RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证应用场景:
RIP-Seq:用于构建目的蛋白的RNA互作组数据,或用于不同遗传背景/实验条件下的互作组差异。
RIP-qPCR:用于验证目的蛋白和候选RNA的相互作用关系,或用于不同遗传背景/实验条件下的互作变化。
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=5c38281f8efcc3ceb4c0c93ba245d6b7/ffaf851001e939013a1729033dec54e736d19668.jpg?tbpicau=2024-06-26-05_d9a98f425622e6bf2251e1244bd480da)
RIP-Seq是一种检测细胞内蛋白/RNA互作组的高通量技术。该技术通过联合免疫共沉淀技术和RNA测序技术对目的蛋白在特定细胞/组织内的互作蛋白/RNA,进行系统的检测和分析。该技术适用于目的蛋白在特定细胞/组织中的蛋白/RNA互作组数据检测,或用于不同遗传背景/实验条件下的互作组差异研究。因此,该技术是研究细胞内蛋白/RNA互作调控网络的常规前置技术。
RIP-qPCR是一种检测细胞内蛋白/RNA互作的靶向验证技术。该技术通过联合免疫共沉淀技术和RT-qPCR检测技术,对目的蛋白在特定细胞/组织内的蛋白/RNA互作关系进行验证,明确蛋白/RNA的相互作用关系。该技术适用于目的蛋白在特定细胞/组织中的蛋白/RNA互作检测验证,或用于不同遗传背景/实验条件下的互作差异研究。因此,该技术是研究细胞内蛋白/RNA互作调控网络的常规检测技术。
RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证技术价值:
(1)蛋白与RNA相互作用数据,是探究转录后调控机制研究的重要内容,体现机制研究的深度,能明显提升临床基础类研究文章的档次。
(2)蛋白与RNA互作组检测,常用于RBP蛋白的结合谱研究,如m6A-RIP-Seq。但理论上蛋白和RNA生物大分子,均有结合调控的可能。因此可用于目的蛋白结合RNA调控方向的机制探究,可用于是经典老基因的机制突破。
(3)蛋白与RNA互作,其结合RNA的区域,是进一步研究互作机制和功能的关键内容,能够明显提高机制研究的高度。
RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证方案:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=86025751563853438ccf8729a313b01f/08a2bb1c8701a18b34feb672d82f07082838fe69.jpg?tbpicau=2024-06-26-05_c50fb28fd052d542c7955119f70b8e8f)
RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证要点:
(1)实验设计:尽量进行实验组别设计和生物学重复检测,提高后续验证的阳性率。常规过表达单组(Ab IP vs IgG IP);动态互作组学(实验组vs对照组vs IgG组)。根据目的设计适当的生物学重复。如果后续以RIP-Seq数据进行互作组标准分析,则需要3-4组生物学重复;如果后续以寻找关键互作RNA,进行深入的机制研究,则建议1-2次生物学重复。经验显示单次重复假阳性率达90%。RIP-Seq强烈建议设置实验组别和生物学重复检测。
(2)蛋白表达和细胞量:细胞用量要不少于5e7(金标准:320g离心细胞量50μl,保障项目用量)。本底低表达蛋白,建议使用过表达组进行检测。蛋白表达可根据WB结果或初步根据数据库判定(Proteomics DB,https://www.proteomicsdb.org;Human Protein Atlas,https://www.proteinatlas.org/)。
(3)抗体关键质控:抗体特异性与亲和效价要求高,尽量采用标签抗体或经过CoIP效果验证的抗体。抗体质量参差不齐(WB能检测到预期条带不到1/2,能检测到良好结果的不到1/4)和存在非特异性结合(几乎所有的抗体都存在非特异结合,部分非特异结合条带远大于目的条带),RIP-Seq需做WB和IP-WB质控。抗体可参考数据库(Validated Antibody DB, https://www.labome.com/index.html)。
(4)IP送样建议:由于RIP的产物量极少,需要微量建库,强烈建议整包交给公司进行RIP-Seq检测和数据分析。
(5)互作蛋白筛选和验证:数据分析以信号强度作为强阳筛选,以文献查阅,功能匹配,批量RIP-qPCR验证,提高验证成功率。
RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证优劣势:
优势:高通量获得目的蛋白的专属RNA互作库,获得目的蛋白的互作RNA机制分子。
劣势:RIP-Seq的RNA库鱼龙混杂,包含目的蛋白的直接/间接的互作RNA,非特异结合,残留RNA。RIP-Seq技术和分析门槛高;RIP-qPCR验证成功率低,导致研发进展反复跌宕、时间和经费成本占用较大,严重影响士气。该项目的成功实施,比较依赖成熟和有分析经验的团队,强烈建议整包交给专业的服务商开展检测。
RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证案例:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=7f2388d5fa3eb13544c7b7b3961ea8cb/b9f1e150352ac65cef11c24ebdf2b21193138a6a.jpg?tbpicau=2024-06-26-05_84c365831955ee6656700129f750b6a8)
RIP-Seq互作组验证,即在互作组分析筛选的基础上,进一步利用RIP-qPCR技术对感兴趣分子进行靶向检测,更加精细,也是互作组验证的必由之路。
RIP-Seq:用于构建目的蛋白的RNA互作组数据,或用于不同遗传背景/实验条件下的互作组差异。
RIP-qPCR:用于验证目的蛋白和候选RNA的相互作用关系,或用于不同遗传背景/实验条件下的互作变化。
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=5c38281f8efcc3ceb4c0c93ba245d6b7/ffaf851001e939013a1729033dec54e736d19668.jpg?tbpicau=2024-06-26-05_d9a98f425622e6bf2251e1244bd480da)
RIP-Seq是一种检测细胞内蛋白/RNA互作组的高通量技术。该技术通过联合免疫共沉淀技术和RNA测序技术对目的蛋白在特定细胞/组织内的互作蛋白/RNA,进行系统的检测和分析。该技术适用于目的蛋白在特定细胞/组织中的蛋白/RNA互作组数据检测,或用于不同遗传背景/实验条件下的互作组差异研究。因此,该技术是研究细胞内蛋白/RNA互作调控网络的常规前置技术。
RIP-qPCR是一种检测细胞内蛋白/RNA互作的靶向验证技术。该技术通过联合免疫共沉淀技术和RT-qPCR检测技术,对目的蛋白在特定细胞/组织内的蛋白/RNA互作关系进行验证,明确蛋白/RNA的相互作用关系。该技术适用于目的蛋白在特定细胞/组织中的蛋白/RNA互作检测验证,或用于不同遗传背景/实验条件下的互作差异研究。因此,该技术是研究细胞内蛋白/RNA互作调控网络的常规检测技术。
RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证技术价值:
(1)蛋白与RNA相互作用数据,是探究转录后调控机制研究的重要内容,体现机制研究的深度,能明显提升临床基础类研究文章的档次。
(2)蛋白与RNA互作组检测,常用于RBP蛋白的结合谱研究,如m6A-RIP-Seq。但理论上蛋白和RNA生物大分子,均有结合调控的可能。因此可用于目的蛋白结合RNA调控方向的机制探究,可用于是经典老基因的机制突破。
(3)蛋白与RNA互作,其结合RNA的区域,是进一步研究互作机制和功能的关键内容,能够明显提高机制研究的高度。
RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证方案:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=86025751563853438ccf8729a313b01f/08a2bb1c8701a18b34feb672d82f07082838fe69.jpg?tbpicau=2024-06-26-05_c50fb28fd052d542c7955119f70b8e8f)
RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证要点:
(1)实验设计:尽量进行实验组别设计和生物学重复检测,提高后续验证的阳性率。常规过表达单组(Ab IP vs IgG IP);动态互作组学(实验组vs对照组vs IgG组)。根据目的设计适当的生物学重复。如果后续以RIP-Seq数据进行互作组标准分析,则需要3-4组生物学重复;如果后续以寻找关键互作RNA,进行深入的机制研究,则建议1-2次生物学重复。经验显示单次重复假阳性率达90%。RIP-Seq强烈建议设置实验组别和生物学重复检测。
(2)蛋白表达和细胞量:细胞用量要不少于5e7(金标准:320g离心细胞量50μl,保障项目用量)。本底低表达蛋白,建议使用过表达组进行检测。蛋白表达可根据WB结果或初步根据数据库判定(Proteomics DB,https://www.proteomicsdb.org;Human Protein Atlas,https://www.proteinatlas.org/)。
(3)抗体关键质控:抗体特异性与亲和效价要求高,尽量采用标签抗体或经过CoIP效果验证的抗体。抗体质量参差不齐(WB能检测到预期条带不到1/2,能检测到良好结果的不到1/4)和存在非特异性结合(几乎所有的抗体都存在非特异结合,部分非特异结合条带远大于目的条带),RIP-Seq需做WB和IP-WB质控。抗体可参考数据库(Validated Antibody DB, https://www.labome.com/index.html)。
(4)IP送样建议:由于RIP的产物量极少,需要微量建库,强烈建议整包交给公司进行RIP-Seq检测和数据分析。
(5)互作蛋白筛选和验证:数据分析以信号强度作为强阳筛选,以文献查阅,功能匹配,批量RIP-qPCR验证,提高验证成功率。
RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证优劣势:
优势:高通量获得目的蛋白的专属RNA互作库,获得目的蛋白的互作RNA机制分子。
劣势:RIP-Seq的RNA库鱼龙混杂,包含目的蛋白的直接/间接的互作RNA,非特异结合,残留RNA。RIP-Seq技术和分析门槛高;RIP-qPCR验证成功率低,导致研发进展反复跌宕、时间和经费成本占用较大,严重影响士气。该项目的成功实施,比较依赖成熟和有分析经验的团队,强烈建议整包交给专业的服务商开展检测。
RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证案例:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=7f2388d5fa3eb13544c7b7b3961ea8cb/b9f1e150352ac65cef11c24ebdf2b21193138a6a.jpg?tbpicau=2024-06-26-05_84c365831955ee6656700129f750b6a8)
RIP-Seq互作组验证,即在互作组分析筛选的基础上,进一步利用RIP-qPCR技术对感兴趣分子进行靶向检测,更加精细,也是互作组验证的必由之路。