RIP实验详细操作方法:
一、细胞裂解(对于单层细胞或贴壁细胞)
1.用10 mL冰冷的PBS洗涤培养瓶或平板上的细胞两次。
2.加入10 mL冰冷的PBS。从每个培养瓶或平板上刮下细胞,然后转移到离心管。
3.通过在4℃下以1500 rpm离心5分钟来收集细胞,并丢弃上清液。
4.在等体积的完全RIP裂解缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。通过上下移液混合,直到细胞被分散,混合物呈现均匀。将裂解液放在冰上孵育5 min。这一步允许低渗RIP缓冲液膨胀细胞。将每个裂解液的~200 μL分配到无核酸酶的微离心管中,并在-80℃下保存。
二、 免疫沉淀用磁珠的制备
1.将50 µL的磁珠悬浮液转移到每个管上(分组:Ab vs IgG)。
2.每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液,短暂涡旋,将管子放在磁性分离器上,去上清。
3.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液,短暂涡旋。
4.将试管放在磁性分离器上,然后弃用上清液。
5.从磁铁上取出试管,并在100 µL的RIP洗涤缓冲液中重新悬浮珠子。在试管中加入目标抗体的~5 µg。
6.在室温下旋转孵育30分钟。
7.将试管短暂离心,放置在磁性分离器上,弃用上清液。
8.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液,短暂涡旋。
9.将试管放在磁性分离器上,然后弃用上清液。重复清洗1次
10.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液,短暂涡旋。把管子放在冰上。
三、RNA结合蛋白-RNA复合物的免疫沉淀(RIP)免疫沉淀
1.制备RIP免疫共沉淀缓冲液。每次免疫沉淀需要900 μL的RIP免疫沉淀缓冲液。每个反应在860 µL的RIP洗涤缓冲液中加入35 μL的0.5 M EDTA和5 µL的RNase抑制剂。
2.将第二节第10步中的试管放在磁性分离器上,并丢弃上清液。在每根试管中加入900 µL的RIP免疫共沉淀缓冲液。
3.快速解冻RIP裂解液(来自第一部分),在4℃下以14000 rpm离心10分钟。取出100 µL的上清液,加入RIP免疫沉淀缓冲液中的每个磁珠-抗体复合物。免疫共沉淀反应的最终体积将为1.0 mL。
4.取出10 µL的RIP裂解液上清液,并将其放入一个新的试管中,并贴上“input”的标签。将该样本存储在-80°C,直到开始RNA纯化(第四节)。这代表“10%的input”,将用于生成标准曲线或用于RT-PCR方法的比较(实时或终点)。
5.取出10 µL的RIP裂解液上清液,通过蛋白印迹法检测目标RNA binding蛋白的表达。将10 µL的2 X SDS-PAGE loading 缓冲液加入到10 µL的RIP裂解液中,然后在95°C下加热。RIP裂解液可直接应用于SDS-PAGE。
6.将所有的试管在4°C下旋转孵育3小时至过夜。
7.将免疫沉淀管短暂离心,放置在磁性分离器上,弃用上清液。
8.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液,短暂涡旋。(重复清洗5次)
9.在最后一次洗涤中,将500 µL的珠子悬液中各取出50µL,通过免疫印迹法检测免疫沉淀的效率。在1X SDS-PAGE加载缓冲液中重新悬浮珠子,然后在95°C加热,可以洗脱蛋白质。然后可以离心,上清液直接应用于SDS-PAGE上。
四、RNA纯化
1.制备蛋白酶K缓冲液。每个免疫沉淀需要150 µL蛋白酶K缓冲液,包含117 µL RIP洗涤缓冲液,15 µL 10% SDS,18 µL 10 mg/mL蛋白酶K。
2.在150µL的蛋白酶K缓冲液中重新悬浮第三节第8步中的每个免疫沉淀。
3.将第三节第4步的input样品解冻,在试管中加入107 µL RIP洗涤缓冲液、15 µL 10% SDS和18 µL蛋白酶K,使体积提高到150 µL。
4.将所有试管在55°C下摇晃孵育30分钟以消化蛋白质。
5.孵育后,将管短暂离心,并将管放置在磁分离器上。将上清液转移到一个新的试管中。
6.在上清液的试管中加入250 µL RIP洗涤缓冲液。
7.在每根试管中加入400 µL的苯酚:氯仿:异戊醇。涡旋15秒,在室温下以14000 rpm离心10分钟,以分离相位。
8.小心地取出350 μL水相,将其放入新管中。加入400 µL的氯仿。涡旋15秒,在室温下以14000 rpm离心10分钟,以分离相位。
9.小心地取出300 μL的水相,然后放入一个新的试管中。
10.在每根试管中加入50 µL盐溶液I、15 µL盐溶液II、5 µL沉淀增强剂和850 µL无水乙醇。混合并在-80°C下保持1小时至过夜,以沉淀RNA。
11.在4°C下以14000 rpm离心30分钟,小心丢弃上清液。
12.用80%的乙醇清洗沉淀一次。在4°C下以14000 rpm离心15分钟。小心地弃出上清液,晾干沉淀。重新悬浮在10到20 µL的无RNase的水中,并将管子放在冰上。
五、将RNA反转录成cDNA
1.标记适当数量的0.2 mL PCR管,以供分析的样本数量,并放在冰上。
2.将9 μL(最多2 μg)的RNA加入PCR管中,放在冰上。
3.在每个PCR反应管的在冰上加入适量的试剂,如表所示
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=c16770f0df25bc312b5d01906ede8de7/0212d1a20cf431ad277de6070d36acaf2fdd9883.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_df0e9291d40932a18946f540f579be4c)
4.将PCR反应管置于热循环器中。
5.启动以下RT反应程序:37℃,1 h; 95℃, 5 min, 4℃保存。
6.取下PCR管。用180 μL无核酸酶水(稀释10倍)稀释产物。产物可以存储在-20°C。
六、 qPCR检测
在qPCR管中配制如下混合液
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=0d6c092bfa315c6043956be7bdb0cbe6/60070df431adcbef9b9bdb38eaaf2edda2cc9f83.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_5b079551eab369710f278001c965cc95)
2.按下列条件进行qPCR反应![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=77b72c3f1a6034a829e2b889fb1249d9/bc5130adcbef7609a5a43ca168dda3cc7dd99e83.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_b30f99fd3facbd835fa9f793851bd886)
七、实验结果
7.1抗体在细胞样本中表达验证(质控1)例如:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=53a3cc6e72a85edffa8cfe2b795509d8/8108caef76094b36433dbed3e5cc7cd98c109d83.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_7d19c655205f6894729eda1284ec5fd8)
结果说明:目的蛋白在目的样本中表达正常,说明抗体有效,样本中蛋白没有发生降解,可进行后续RIP实验。
7.2RIP-WB验证(质控2)例如:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=acf2a4a618df8db1bc2e7c6c3922dddb/7b4a77094b36acafde4f33c23ad98d1000e99c83.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_e3745b79648487454b0e29c30e6e9b58)
结果说明:目标蛋白的抗体把自身蛋白特异性沉淀下来,说明该抗体可以进行IP实验。
7.3 RIP富集后的RNA Qubit检测浓度(seq项目-质控3)例如:![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=c53aced1cbb1cb133e693c1bed5556da/c6ac4a36acaf2edd525eecd7cb1001e938019383.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_e6f4fdac80414c9ab402a2445cc30e73)
结果说明:一般IP组产物RNA浓度远大于阴性对照组IgG产物浓度。
7.4 qPCR结果
例如:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=ac4d1dbf8d1349547e1ee86c664f92dd/fb93adaf2edda3cc8e4b1d1e47e93901203f9283.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_91f1a876fcdd45550417768bb8a02947)
结果说明:通过RIP-qPCR验证circRNA和FOXA1/TET1互作。
本次实验的目的是使用RIP-seq或者RIP-qPCR的方法,通过在目的细胞中运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或qPCR分析,寻找目标蛋白的互作RNA分子,或在不同遗传背景或处理条件下的互作变化。
广州基云生物拥有资深的项目管理专家和经验丰富的技术团队,提供专业的研究方案、严格项目质控、科学的数据分析,为互作机制提供专业建议,助力快速获取互作机制分子,突破互作机制研究瓶颈难题。
参考文献:hsa_circ_0007919 induces LIG1 transcription by binding to FOXA1/TET1 to enhance the DNA damage response and promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma. Molecular cancer. 2023.
一、细胞裂解(对于单层细胞或贴壁细胞)
1.用10 mL冰冷的PBS洗涤培养瓶或平板上的细胞两次。
2.加入10 mL冰冷的PBS。从每个培养瓶或平板上刮下细胞,然后转移到离心管。
3.通过在4℃下以1500 rpm离心5分钟来收集细胞,并丢弃上清液。
4.在等体积的完全RIP裂解缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。通过上下移液混合,直到细胞被分散,混合物呈现均匀。将裂解液放在冰上孵育5 min。这一步允许低渗RIP缓冲液膨胀细胞。将每个裂解液的~200 μL分配到无核酸酶的微离心管中,并在-80℃下保存。
二、 免疫沉淀用磁珠的制备
1.将50 µL的磁珠悬浮液转移到每个管上(分组:Ab vs IgG)。
2.每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液,短暂涡旋,将管子放在磁性分离器上,去上清。
3.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液,短暂涡旋。
4.将试管放在磁性分离器上,然后弃用上清液。
5.从磁铁上取出试管,并在100 µL的RIP洗涤缓冲液中重新悬浮珠子。在试管中加入目标抗体的~5 µg。
6.在室温下旋转孵育30分钟。
7.将试管短暂离心,放置在磁性分离器上,弃用上清液。
8.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液,短暂涡旋。
9.将试管放在磁性分离器上,然后弃用上清液。重复清洗1次
10.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液,短暂涡旋。把管子放在冰上。
三、RNA结合蛋白-RNA复合物的免疫沉淀(RIP)免疫沉淀
1.制备RIP免疫共沉淀缓冲液。每次免疫沉淀需要900 μL的RIP免疫沉淀缓冲液。每个反应在860 µL的RIP洗涤缓冲液中加入35 μL的0.5 M EDTA和5 µL的RNase抑制剂。
2.将第二节第10步中的试管放在磁性分离器上,并丢弃上清液。在每根试管中加入900 µL的RIP免疫共沉淀缓冲液。
3.快速解冻RIP裂解液(来自第一部分),在4℃下以14000 rpm离心10分钟。取出100 µL的上清液,加入RIP免疫沉淀缓冲液中的每个磁珠-抗体复合物。免疫共沉淀反应的最终体积将为1.0 mL。
4.取出10 µL的RIP裂解液上清液,并将其放入一个新的试管中,并贴上“input”的标签。将该样本存储在-80°C,直到开始RNA纯化(第四节)。这代表“10%的input”,将用于生成标准曲线或用于RT-PCR方法的比较(实时或终点)。
5.取出10 µL的RIP裂解液上清液,通过蛋白印迹法检测目标RNA binding蛋白的表达。将10 µL的2 X SDS-PAGE loading 缓冲液加入到10 µL的RIP裂解液中,然后在95°C下加热。RIP裂解液可直接应用于SDS-PAGE。
6.将所有的试管在4°C下旋转孵育3小时至过夜。
7.将免疫沉淀管短暂离心,放置在磁性分离器上,弃用上清液。
8.从磁铁上取下试管。每管中加入0.5 mL RIP洗涤缓冲液,短暂涡旋。(重复清洗5次)
9.在最后一次洗涤中,将500 µL的珠子悬液中各取出50µL,通过免疫印迹法检测免疫沉淀的效率。在1X SDS-PAGE加载缓冲液中重新悬浮珠子,然后在95°C加热,可以洗脱蛋白质。然后可以离心,上清液直接应用于SDS-PAGE上。
四、RNA纯化
1.制备蛋白酶K缓冲液。每个免疫沉淀需要150 µL蛋白酶K缓冲液,包含117 µL RIP洗涤缓冲液,15 µL 10% SDS,18 µL 10 mg/mL蛋白酶K。
2.在150µL的蛋白酶K缓冲液中重新悬浮第三节第8步中的每个免疫沉淀。
3.将第三节第4步的input样品解冻,在试管中加入107 µL RIP洗涤缓冲液、15 µL 10% SDS和18 µL蛋白酶K,使体积提高到150 µL。
4.将所有试管在55°C下摇晃孵育30分钟以消化蛋白质。
5.孵育后,将管短暂离心,并将管放置在磁分离器上。将上清液转移到一个新的试管中。
6.在上清液的试管中加入250 µL RIP洗涤缓冲液。
7.在每根试管中加入400 µL的苯酚:氯仿:异戊醇。涡旋15秒,在室温下以14000 rpm离心10分钟,以分离相位。
8.小心地取出350 μL水相,将其放入新管中。加入400 µL的氯仿。涡旋15秒,在室温下以14000 rpm离心10分钟,以分离相位。
9.小心地取出300 μL的水相,然后放入一个新的试管中。
10.在每根试管中加入50 µL盐溶液I、15 µL盐溶液II、5 µL沉淀增强剂和850 µL无水乙醇。混合并在-80°C下保持1小时至过夜,以沉淀RNA。
11.在4°C下以14000 rpm离心30分钟,小心丢弃上清液。
12.用80%的乙醇清洗沉淀一次。在4°C下以14000 rpm离心15分钟。小心地弃出上清液,晾干沉淀。重新悬浮在10到20 µL的无RNase的水中,并将管子放在冰上。
五、将RNA反转录成cDNA
1.标记适当数量的0.2 mL PCR管,以供分析的样本数量,并放在冰上。
2.将9 μL(最多2 μg)的RNA加入PCR管中,放在冰上。
3.在每个PCR反应管的在冰上加入适量的试剂,如表所示
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=c16770f0df25bc312b5d01906ede8de7/0212d1a20cf431ad277de6070d36acaf2fdd9883.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_df0e9291d40932a18946f540f579be4c)
4.将PCR反应管置于热循环器中。
5.启动以下RT反应程序:37℃,1 h; 95℃, 5 min, 4℃保存。
6.取下PCR管。用180 μL无核酸酶水(稀释10倍)稀释产物。产物可以存储在-20°C。
六、 qPCR检测
在qPCR管中配制如下混合液
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=0d6c092bfa315c6043956be7bdb0cbe6/60070df431adcbef9b9bdb38eaaf2edda2cc9f83.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_5b079551eab369710f278001c965cc95)
2.按下列条件进行qPCR反应
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=77b72c3f1a6034a829e2b889fb1249d9/bc5130adcbef7609a5a43ca168dda3cc7dd99e83.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_b30f99fd3facbd835fa9f793851bd886)
七、实验结果
7.1抗体在细胞样本中表达验证(质控1)例如:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=53a3cc6e72a85edffa8cfe2b795509d8/8108caef76094b36433dbed3e5cc7cd98c109d83.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_7d19c655205f6894729eda1284ec5fd8)
结果说明:目的蛋白在目的样本中表达正常,说明抗体有效,样本中蛋白没有发生降解,可进行后续RIP实验。
7.2RIP-WB验证(质控2)例如:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=acf2a4a618df8db1bc2e7c6c3922dddb/7b4a77094b36acafde4f33c23ad98d1000e99c83.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_e3745b79648487454b0e29c30e6e9b58)
结果说明:目标蛋白的抗体把自身蛋白特异性沉淀下来,说明该抗体可以进行IP实验。
7.3 RIP富集后的RNA Qubit检测浓度(seq项目-质控3)例如:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=c53aced1cbb1cb133e693c1bed5556da/c6ac4a36acaf2edd525eecd7cb1001e938019383.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_e6f4fdac80414c9ab402a2445cc30e73)
结果说明:一般IP组产物RNA浓度远大于阴性对照组IgG产物浓度。
7.4 qPCR结果
例如:
![](http://tiebapic.baidu.com/forum/w%3D580/sign=ac4d1dbf8d1349547e1ee86c664f92dd/fb93adaf2edda3cc8e4b1d1e47e93901203f9283.jpg?tbpicau=2024-07-08-05_91f1a876fcdd45550417768bb8a02947)
结果说明:通过RIP-qPCR验证circRNA和FOXA1/TET1互作。
本次实验的目的是使用RIP-seq或者RIP-qPCR的方法,通过在目的细胞中运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或qPCR分析,寻找目标蛋白的互作RNA分子,或在不同遗传背景或处理条件下的互作变化。
广州基云生物拥有资深的项目管理专家和经验丰富的技术团队,提供专业的研究方案、严格项目质控、科学的数据分析,为互作机制提供专业建议,助力快速获取互作机制分子,突破互作机制研究瓶颈难题。
参考文献:hsa_circ_0007919 induces LIG1 transcription by binding to FOXA1/TET1 to enhance the DNA damage response and promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma. Molecular cancer. 2023.